人体组织的拉曼光谱可以提供独特的生化“指纹”，这一指纹会随着疾病的进展而发生变化。照射到组织上的光会发生散射，并可能发生波长变化，这种变化可以用拉曼光谱来表示。研究设计了一种可插入结肠镜辅助通道的共聚焦光纤拉曼探针。本体外研究旨在评估使用该探针进行拉曼光谱分析对结肠病理诊断的准确性。在结肠镜检查过程中采集活检样本，快速冷冻后储存于-80°C。将探针尖端与解冻后的标本黏膜表面接触，分别采集10秒和1秒的拉曼光谱。通过主成分分析（PCA）结合线性判别分析（LDA）的数学建模方法，将拉曼光谱与组织病理学诊断结果进行关联分析。共从177名患者的356份结肠活检样本中采集了375条拉曼光谱（包括81份正常结肠黏膜、79份增生性息肉、92份腺瘤性息肉、64份腺癌和40份溃疡性结肠炎）。10秒采集的光谱在不同病理类型之间的分类准确率范围为72.1%至95.9%，1秒采集的光谱准确率范围为61.5%至95.1%。在将组织分为正常、腺瘤性和腺癌三类的模型中，10秒采集的准确率为74.1%，1秒采集的准确率为63.5%。该共聚焦拉曼探针系统能够区分不同的结直肠病理类型。该探针有望将拉曼光谱技术发展为结肠镜检查中即时诊断的临床工具。
一、引言
组织学病理分析取自结肠黏膜肉眼异常区域的活检，是炎症性肠病、增生性息肉、腺瘤和腺癌诊断的金标准。英国国家医疗服务体系肠癌筛查项目显著增加了病理实验室的工作量。柔性乙状结肠镜已被证明是一种有效的筛查方法，其推广可能进一步加重病理负担。
展开剩余87%结肠镜光学光谱与成像技术可在细胞水平表征组织，可能成为白光内镜的有益补充。照射组织的光被散射并可能发生波长改变，这种非弹性散射光可被记录为拉曼光谱。人体组织的拉曼光谱可提供独特的生化“指纹”。
已有多种设计不同、性能各异的拉曼探针被用于多种组织。本研究团队近期开发了一款共聚焦拉曼探针，其直径足够小，可经内镜活检通道插入，并实现了组织的快速评估。该探针已成功用于食管癌发生机制的研究，但尚未用于结直肠病理评估。本研究使用改良版探针，采用单根照明/采集光纤，通过单一物镜实现共聚焦照明与采集，从而精确采集表层黏膜信号而非深层信号。探针在空气中的景深约150 μm，但设计为与组织接触并轻压，使实际采样深度更大；进一步散射过程将采样深度延伸至黏膜/黏膜下层深部。
拉曼光谱有望通过经内镜辅助通道插入的光纤探针实现活体病理诊断，从而在镜检时即刻获得组织学诊断，患者无需等待常规病理报告。
本研究旨在评估该拉曼探针系统在临床可行采集时间内区分正常组织、增生性息肉、腺瘤、腺癌及炎症性肠病组织的能力。这是一项体外初步研究，将结肠镜活检标本的拉曼光谱与组织病理学结果进行对比。该系统未来有望用于活体结肠镜检查。
二、方法
2.1 伦理审批与标本采集研究获Frenchay研究伦理委员会批准，计划招募最多500名患者。研究助理在场时，于结肠镜检查过程中用活检钳采集标本。活检大小通常为数毫米，同一患者可采集多枚。对圈套器电切后的息肉，用刀片自边缘切取数毫米至1 cm厚的切片，避免累及蒂部及纵轴，该方案与资深病理顾问共同制定，以确保不影响剩余组织的常规病理评估。标本在双目显微镜下黏膜面朝上贴附于醋酸纸，置入2 ml冻存管后立即液氮速冻，于-80°C保存直至光谱实验。
2.2 光谱采集标本被动复温至室温，显微镜确认黏膜面朝上后，将探针尖端与标本接触采集光谱。采集结束后标本常规甲醛固定、制片，由胃肠病理专家盲法完成诊断。
2.3 拉曼系统探针由Gloucestershire皇家医院生物光子学研究组与Bristol大学界面分析中心联合研制，可经标准结肠镜器械通道插入。本研究将探针尖端球透镜替换为平口渐变折射率透镜，可与黏膜直接接触。探针连接Renishaw 100型光谱仪，激发光为Innovative Photonic Solutions 830 nm二极管激光，功率60 mW，光斑直径约1 mm。散射光经探针及光纤返回CCD检测。对复温标本黏膜面分别进行10 s与1 s光谱采集；大活检偶尔于不同位点二次采集。每日用硅、聚四氟乙烯、绿玻璃及氖灯校准系统，硅520.4 nm峰校准波数轴，绿玻璃荧光光谱校正系统响应。
2.4 统计学分析效能计算假设拉曼光谱对组织类型识别敏感度80%、标准误5%，则每类需64例。经病理专家确认的诊断类别为：正常、增生性息肉、腺瘤、腺癌、溃疡性结肠炎。采用MATLAB进行多变量分析：主成分分析提取光谱差异，线性判别分析建立分类模型，并以组织病理为金标准。模型性能以留一光谱交叉验证评估。先建立两两病理类别模型，再建立“正常-腺瘤-腺癌”三分类模型。
三、结果
共纳入177例患者356枚活检，多数采集于2010年2月至2011年2月，少量为2008年样本。未发生不良事件。表1列出各病理类型例数、患者 demographics 及光谱数。所有腺瘤均为低级别上皮内瘤变，含54例管状腺瘤、37例管状绒毛状腺瘤及1例绒毛状腺瘤，合并分析；少数高级别瘤变未纳入。无黏液癌或印戒细胞癌。溃疡性结肠炎活检均经复核确认为活动期。
表1.
3.1 平均光谱经二阶多项式基线校正后的平均光谱见图2 典型上皮组织拉曼峰与文献一致：1655–1659 cm⁻¹（蛋白酰胺I）、1450–1453 cm⁻¹（CH₂弯曲）、1310 cm⁻¹（CH₂扭曲）、1260 cm⁻¹（酰胺III）、1003 cm⁻¹（苯环呼吸），峰相对大小反映组织差异。
图2. 平均校正拉曼光谱（10 s采集）来自五类病理组：蓝色为正常；红色为增生性息肉；绿色为腺瘤；黄色为癌；青色为溃疡性结肠炎。阴影区表示均值±2标准差。光谱已归一化并纵向平移以便视觉区分。
3.2 两分类结果10 s与1 s采集光谱的两组病理分类LOOCV结果见表2. 正常vs腺瘤、正常vs腺癌、正常vs溃疡性结肠炎、增生性息肉vs腺瘤、腺瘤vs腺癌、肿瘤（腺瘤+腺癌）vs溃疡性结肠炎的准确率介于61.5–95.9%。表2. 结肠活检拉曼探针光谱（10 s与1 s采集）留一交叉验证分类表现。
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3.3 三分类结果图3. 给出10 s光谱正常、腺瘤、腺癌三组的线性判别得分图，显示组间可分离。LOOCV对正常、腺瘤、腺癌的识别率分别为90.1%、63.4%、71.2%（10 s）及85.2%、54.3%、53.4%（1 s），总体准确率74.1%（10 s）与63.5%（1 s）。
图3. 三组探针光谱（10 s采集）线性判别得分图：正常（蓝）、腺瘤（红）、腺癌（绿）。
四、讨论
多个研究中心已在生物组织中探索拉曼光谱，但该技术尚未进入常规临床应用。本研究是迄今使用拉曼探针诊断多种结直肠组织类型样本量最大的报道，证实了其在常规实践中的潜力。10 s光谱采集获得的准确率高于1 s采集，符合信噪比随积分时间延长的预期。
所有两两病理类别模型的建立均以50% 随机水平为基准。正常与异常组织的区分准确率在10 s采集下为72.1–95.9%，1 s采集下为61.5–95.1%。临床实践中，黏膜肉眼外观通常可提示正常或异常，但在慢性腹泻病例，结肠镜下表现正常却可能存在显微镜结肠炎，此时随机活检方可发现。留一交叉验证将正常组织与溃疡性结肠炎组织分开的准确率达95.9%（10 s）与95.1%（1 s）；本研究IBD活检均取自肉眼炎症肠段。未来研究可比较正常与显微镜结肠炎的光谱差异，以评估拉曼探针能否在看似正常的黏膜中发现隐匿炎症。
若结肠镜下黏膜外观正常，通常不考虑肿瘤进程，例外情况是IBD，其平坦型异增区域在白光内镜下难以识别。本研究未纳入IBD相关平坦异增病灶，未来需收集足够样本进一步验证。溃疡性结肠炎与肿瘤（腺瘤+腺癌）的区分准确率为72.1%（10 s）与67.0%（1 s），提示在炎症背景下识别肿瘤存在挑战，但仍优于随机水平。
临床决策中，增生性息肉与腺瘤的鉴别至关重要。拉曼探针留一交叉验证对两者的区分准确率为77.8%（10 s）与63.9%（1 s）。目前对是否必须切除增生性息肉仍有争议，一般认为其恶变潜能极低；然而有研究提示部分右半结肠增生性息肉可能参与锯齿状癌变通路。小的直肠或左半结肠增生性息肉常被内镜医师忽略，且微小息肉镜下鉴别困难。若拉曼探针可在镜下实时区分，将避免不必要的息肉切除。
腺瘤与腺癌的区分同样具有临床意义：腺癌需行肠段切除，而腺瘤若宏观条件合适可考虑局部切除（如黏膜下剥离）。拉曼探针对两者的识别准确率为73.6%（10 s）与61.5%（1 s）。按定义，腺瘤与腺癌均属肿瘤，但后者具备浸润特征。由于腺瘤可逐步进展为腺癌，两者生化差异可能细微，拉曼光谱仍能实现一定程度的区分，提示癌变过程中已出现可探测的生化改变。随着技术改进，有望实现临床可用的探针系统。
传统活检受限于取样误差：同一病灶可能同时包含腺瘤、腺癌及正常/炎症区域；且石蜡切片仅提供活检组织的极小断面，可能遗漏关键病理。若拉曼探针临床化，可在镜下对同一病灶进行无限次“光学活检”。例如，同一区域采集6条光谱，若3条判为腺癌、2条腺瘤、1条正常，则即便按“多数表决”敏感度为50%，探针仍可能100% 识别到腺癌存在。
若拉曼光谱欲成为临床诊断工具，需开发足够安全、稳健且准确的系统。本研究获得的诊断敏感度尚未达到临床要求，但技术发展仍值得鼓励。理想情况下，该技术应具备极高敏感度与特异度，且不取代组织病理学。高质量病理评估提供的信息远多于单纯诊断，众多情形下完全替代病理并不可取。
现实的应用场景可能包括：
溃疡性结肠炎异增监测中，辅助定位平坦型异增区域； 在大型绒毛管状腺瘤内，精准识别可疑腺癌灶； 区分微小增生性息肉与腺瘤，减少不必要的活检或切除； 若腺癌诊断准确率进一步提高，可省去术前常规活检，于结肠镜下即时告知患者，后续手术标本再由病理提供详细分期信息。拉曼光谱亦可与窄带成像或染色内镜联合，协助确定需活检的精确位点。
尽管本研究证实拉曼探针具有临床潜力，仍需在以下方面改进：采用更先进的数据处理算法（如支持向量机）；优化探针结构以提高稳定性。本项目使用的光谱采集与分析软件已可配置为实时信号处理，为未来实时诊断奠定基础。最终需通过前瞻性临床试验评估其临床价值，并开展成本-效益分析。
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